rProteinA/G Beads 4FF 瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)

貨號 ：R8280

規(guī)格 ：5ml

保存 ：2-8℃

產(chǎn)品介紹 ：

     rProtein A/G Beads 是將  rProtein A/G 高密度定向偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠微球表面，該產(chǎn)品具有更高的抗體結(jié)合能力和較低的蛋白非特異吸附率， 洗脫條件更均一， 一步純化即可從血清樣品中分離出純度大于 90%的抗體。

rProtein A/G Beads 產(chǎn)品性能 ：

指標(biāo)  性能

基質(zhì)  4%瓊脂糖微球

配體  重組蛋白 A/G

載量   >30mg 人  lgG/ml 介質(zhì)

粒徑  (µm)  45- 165

大流速    0.1 MPa, 1 bar

 pH 穩(wěn)定范圍  3- 10

儲存緩沖液  20% 乙醇 

儲存溫度   2°C -  8°C

  Protein A  和   Protein G  對不同抗體的結(jié)合能力   ：

種屬 亞型 Protein A  Protein G Protein A/G

  IgA   varible  —   ++

  IgD  —  —  — 

  IgE  —  —  — 

IgG1   ++++   ++++   ++++

IgG2   ++++   ++++  +  +++

IgG3  —   ++++   ++++

IgG4   ++++   ++++   ++++

  Human

  IgM   varible  —   ++

     Avian egg yolk    IgY  —  —  — 

  Cow     ++   ++++   ++++

  Dog     ++++   ++   ++++

  Goat    —   ++++  ++++

IgG1   ++++   ++   ++++      Guinea pig

IgG2   ++++   ++  ++++

  Hamster   +   ++  

  Horse      Total IgG   ++   ++++   ++++

  Koala    —   +  

  Liama    —   +  

  Monkey(rhesus)     ++++   ++++  ++++

IgG1   +   ++++   ++

  IgG2a   ++++   ++++   ++++

  IgG2b   +++   +++   +++

IgG3   ++   +++   +++

Mouse

  IgM   variable  —  —

  Pig     +++   +++   ++++

Ra   bbit      Total IgG   ++++   +++   ++++

IgG1  —   +   ++

  IgG2a  —   ++++   ++++

  IgG2b  —   ++   ++

  Rat

IgG3   +   ++  ++

  Sheep      Total IgG  +/-   ++   ++

++++=結(jié)合能力強(qiáng)；  ++=結(jié)合能力中等；  —=結(jié)合能力弱或沒有結(jié)合 

純化流程 ：

    本產(chǎn)品分為兩種應(yīng)用： 抗體純化流程和免疫沉淀流程， 免疫沉淀流程還分為直接法和間

接法。下面操作就從這三個方面詳細(xì)介紹。 

1 、Buffer的準(zhǔn)備

所用水和 Buffer 在使用之前建議用  0.22µm 或 0.45 µm 濾膜過濾。 

結(jié)合/ 洗雜 Buffer：   0.15M NaCl，  20 mM Na 2 HPO 4 ，  pH 7.0

洗脫 Buffer： 0.1M 甘氨酸，  pH 3.0

中和液：   1M Tris-HCl， pH8.5

交聯(lián) Buffer： 0.2  M 三乙醇胺，  pH 8.2

終止液：   50 mM Tris，  pH 7.5

2 、 樣品準(zhǔn)備

    上柱之前要確保樣品溶液有合適的離子強(qiáng)度和 pH 值， 可以用結(jié)合/洗雜緩沖液對血清樣

品、腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，或者樣品用結(jié)合/洗雜緩沖液透析。

樣品在上樣前建議離心或用  0.22µm 或 0.45µm 濾膜過濾，減少雜質(zhì)，提高蛋白純化效

率和防止堵塞柱子。 

3 、 抗體純化流程操作方法

抗體純化流程示意圖如下：

 1) 將 rProtein A/G Beads 裝入合適的層析柱，層析用 5 倍柱體積的結(jié)合 Buffer 進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。 

 2) 將樣品加到平衡好的 rProtein A/G Beads 中（保證目的蛋白與 rProtein A Beads 充分接觸，提高目的蛋白的回收率） ，收集流出液。 

 3) 用 10-15 倍柱體積的洗雜 Buffer 進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。 

 4) 使用 5-10 倍柱體積的洗脫  Buffer，收集洗脫液，即目的蛋白組分。 

 5) 依次使用 3 倍柱體積的結(jié)合  Buffer 和 5 倍柱體積的去離子水平衡填料，后再用 5 倍柱體積的 20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的 20%的乙醇中，置于 4 度保存，防止填料被細(xì)菌污染。 

 6) SDS-PAGE 檢測  將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以

及原始樣品使用 SDS-PAGE 檢測純化效果。 

4 、  免疫沉淀直接法操作流程

免疫沉淀直接法操作流程示意圖如下： 

4.1  抗體吸附

1）取適量的 rProtein A/G Beads 加入到  2ml 離心管中，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸棄上清。 

 2) 加入 0.5ml 結(jié)合 Buffer，懸浮填料（使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用） ，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。 

 3) 向步驟  2) 平衡的填料中加入抗體溶液，懸浮填料，室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕

翻轉(zhuǎn)離心管，約 30min 后，500 轉(zhuǎn)離心 1min，收集上清液，留待檢測。 

 4) 向  3) 的填料中加入 0.5ml 的洗雜 Buffer，懸浮填料，進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。 

4.2 抗體交聯(lián) ( 備選)

如果需要將抗體和目標(biāo)抗原復(fù)合物共同洗脫，請忽略本步驟，直接進(jìn)行 4.3。 

1) 向清洗過的填料中加入 1ml 交聯(lián) Buffer，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸棄上清。 

2) 再向其中加入   1ml 20 mM DMP（dimet   yl pimelimidate dihydrochloride）的交聯(lián) Buffer，此試劑需要現(xiàn)用現(xiàn)配，懸浮填料，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，促使Buffer 和填料充分接觸，  約 30min 后，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸棄上清。 

3) 再向其中加入 1ml 終止液，懸浮填料，終止交聯(lián)反應(yīng)，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手

工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，  約 15min 后，500 轉(zhuǎn)離心 1min，再吸棄上清。 

 4) 加入 0.5ml 的洗雜 Buffer，懸浮填料，進(jìn)行清洗，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。 

4.3  抗原沉淀反應(yīng)

 1) 抗原吸附： 加入含有抗原的樣品， 用移液器輕輕吹打使抗原與填料-抗體復(fù)合物均勻分散。在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管 10min，使抗原與抗體充分結(jié)合，如結(jié)合力較弱則可在室溫下反應(yīng) 1h 或者在 4℃下反應(yīng)。 

 2) 洗雜：將上述完成抗原吸附的填料-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行離心，500 轉(zhuǎn)離心 1min，收集

上清液，置于冰上以備后續(xù)檢測。向離心管中加入  1ml 洗雜 Buffer，用移液器輕輕吹打使

填料-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行離心分離，500 轉(zhuǎn)離心 1min，棄上清液。再重復(fù)

洗滌兩次。后加入  1ml 洗雜液，用移液器將填料-抗體-抗原復(fù)合物懸液轉(zhuǎn)移新的

 1.5 ml 離心管中，并進(jìn)行離心分離，500 轉(zhuǎn)離心 1min，棄上清液。 

 3) 抗原洗脫：提供以下兩種抗原洗脫方案，可根據(jù)后期檢測的需要選擇不同的抗原洗脫方

法。 變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于 SDS-PAGE 檢測。向離心管中加入

 25µl 1×SDS-    PAGE Loading Buffer 混合均勻，95℃  加熱 5min。然后進(jìn)行離心，500 轉(zhuǎn)離心1min，收集上清液，進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測。 

非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向離心

管中加入 5 倍柱體積的洗脫 Buffer，用移液器吹打 5 次，  混勻，然后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混

合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，10min 后，離心，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸取上清液，收集洗脫

組分，即為目標(biāo)抗原，收集上清液新的離心管中，并立即加入十分之一體積的中和液，將

洗脫組分 pH 調(diào)節(jié) 7.0-8.0，用于后期功能分析。 

5 免疫沉淀間接法操作流程

免疫沉淀間接法操作流程示意圖如下： 

 1) 抗體與抗原混合：將抗體與含有目的蛋白的裂解液混合，室溫震蕩孵育 30min-60min，或

者 2-8 度孵育，取決于抗體與抗原的結(jié)合效率以及抗原的穩(wěn)定性，需要自己優(yōu)化結(jié)合條

件。形成抗原-抗體混合物。 

注意：抗體的加入量要考慮到下面填料的量，抗體的加入量過多會影響到抗原-抗體混

合物與填料的結(jié)合。建議抗體加入量為填料 80%的大載量。

 2) 填料準(zhǔn)備：取適量的 rProtein A/G Beads 加入到  2ml 離心管中，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸棄

上清。加入 0.5ml 結(jié)合 Buffer，懸浮填料（使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到

保護(hù)蛋白的作用） ，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。 

 3) 抗原-抗體混合物的吸附： 將步驟 2.5.1 中得到的抗原-抗體混合物加入到處理好的填料中，均勻，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，  促使樣品和填料充分接觸并吸附，  約 30min 后，約 30min 后，500 轉(zhuǎn)離心 1min，收集上清液，留待檢測。 

 4) 洗雜：向上述離心管中加入 0.5ml 的洗雜 Buffer，懸浮填料，進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。 

 5) 抗原洗脫：提供以下兩種抗原洗脫方案，可根據(jù)后期檢測的需要選擇不同的抗原洗脫方

法。

變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于 SDS-PAGE 檢測。向離心管中加入

 25µl 1×SDS-    PAGE Loading Buffer 混合均勻，95℃  加熱 5min。然后進(jìn)行離心，200 轉(zhuǎn)離心1min，收集上清液，進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測。 

非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向離心

管中加入 5 倍柱體積的洗脫 Buffer，用移液器吹打 5 次，  混勻，然后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混

合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，10min 后，離心，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸取上清液，收集洗脫

組分，即為目標(biāo)抗原，收集上清液新的離心管中，并立即加入十分之一體積的中和液，將

洗脫組分 pH 調(diào)節(jié) 7.0-8.0，用于后期功能分析。 

填料清洗

rProtein A/G Beads 可以重復(fù)使用而無需再生，但隨著一些變性物質(zhì)的沉淀和蛋白的聚

集，往往造成流速和結(jié)合載量都下降，嚴(yán)重影響柱子的性能，這時需要對樹脂進(jìn)行清洗。 

去除一些沉淀或變性物質(zhì) 用 2 倍柱體積的 6M 鹽酸胍溶液進(jìn)行清洗，然后立即用 5 倍柱體

積的   PBS, pH 7.4 清洗。  去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì) 用 3-4 倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積的 1% Triton  X-100清洗， 然后然后立即用5倍柱體積的   PBS, pH 7.4清洗。 

問題及解決方案

原因分析  推薦解決方案

篩板被堵塞  清洗或更換篩板  柱子反壓過高

填料被堵塞  按照填料清洗部分進(jìn)行樹脂清洗 

裂解液中含有微小的固體顆粒， 建議上柱

前使用濾膜    (0.22 or 0.45 µm) 過濾， 或者離心去除。

去除樣品或柱子中的氣泡  樣品純化過程中曲線不穩(wěn)

樣品或 buffer 中有氣泡

樣品和 buffer 進(jìn)行脫氣

樣品中抗體濃度太低  使用其抗原做配體的介質(zhì)  洗脫組分中沒有目的蛋白 抗體被降解  適當(dāng)?shù)奶岣呦疵?nbsp;pH上樣量太多  減少上樣量  回收率逐漸減低 

柱子太臟，載量降低  按照填料清洗部分進(jìn)行樹脂清洗 

rProteinA/G Beads 4FF 瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)訂購說明：
1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨，一般情況下都能訂貨當(dāng)日發(fā)貨。 
2、部分非常用產(chǎn)品，需提前1－2日預(yù)訂，海外期貨則需要提前3-6周預(yù)訂。 
3、部分產(chǎn)品價格會因貨期、批次等因素發(fā)生變化，若有變動以訂貨當(dāng)日新價格為準(zhǔn)。 
4、每日訂單截止時間為16點整，部分城市可到17點整，因超過截止時間造成當(dāng)日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
5、請辦理完貨款后，將收據(jù)、底單等連同收貨人的地址、姓名、等以傳真、、短信、等形式通知我們。

運(yùn)輸說明：
1、極低溫產(chǎn)品：極低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過程中加裝干冰運(yùn)輸。用干冰把產(chǎn)品包裹起來，再用泡沫盒密封，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實驗保駕護(hù)航。
2、低溫產(chǎn)品：低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過程中加裝索萊寶冰袋運(yùn)輸。事先用冰袋把產(chǎn)品包裹起來，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴(yán)實密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續(xù)一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實驗保駕護(hù)航。
3、常溫產(chǎn)品：常溫產(chǎn)品運(yùn)輸過程中無需加冰或者特殊包裝。產(chǎn)品由公司庫房人員快速配貨，準(zhǔn)確快速高效的快遞保證產(chǎn)品快速送達(dá)您的手中。