無支原體 胎牛血清

無支原體 胎牛血清通常作為補充成分添加在基礎培養基內使用。它能夠提供各種大分子蛋白，小分子量營養，水溶性成分的轉運蛋白，和其它一些細胞在體外所必需的成分，如激素和附著因子。血清可以結合或中和一些生長因子中的有毒成分，并提供培養基的緩沖能力。細胞培養時血清的添加依賴于基礎培養基的化學組成，培養細胞的類型，及所用的培養系統。

我們在提供細胞培養基、平衡鹽溶液、無血清培養基和試劑的同時，還提供高品質的血清。我們對血清制備進行全過程監管。從血清收集到終產品檢驗和內部稽核的每一個步驟，我們都采用設備和標準操作程序，以確保整個過程中每個環節的產品質量。對整個過程的控制可以保證產品的持續高品質，降低不同批次的差異。

處理：全部血清：收集的血液均在冷藏條件下處理。血清和血塊分離后立即將血清合并并冷凍。只有符合我們的檢測標準的血清才被接受作進一步處理。

熱滅活血清：熱滅活是在56℃水浴中嚴格控溫30分鐘。透析血清：用10,000截留分子量的透析膜在0.15M的NaCl中進行透析，直到葡萄糖水平低于5mg/dl(用鄰甲苯胺測試法檢驗)。γ射線照射血清：可按客戶要求對血清進行γ射線照射。通過γ射線照射以滅活各種動物血清(包括胎牛血清、新生牛血清、豬血清和馬血清)中的病毒和支原體的方法已經得到證實。研究證實照射劑量在30-45kGy為宜。血清在此照射后物理化學特性和細胞培養表現沒有變化。裝瓶：粗血清須通過一系列的過濾才成為成品。后的過濾步驟包括使用0.2um和0.1um的無菌過濾。胎牛血清須通過三次0.1um過濾，其他血清須通過0.2um過濾。終產品的質量控制：我們采取以下方法對每一批次的產品選取一定數量的樣品進行質量控制分析：

化學檢測：使用低溫凝固點的方法檢測滲透壓，以保證符合產品規范。我們每天使用國家標準的技術研究所標定的標準溶液對我們的滲透壓檢測儀器進行校準。同樣每天使用國家標準技術研究所標定的標準溶液對pH計進行校準。

使用電泳圖譜鑒定血清的整體性質。樣品被轉移到硝酸纖維素基質中，并在緩沖體系內遷移。條帶經染色、清潔、干燥后用密度儀進行掃描，以檢測白蛋白和球蛋白組分的相對濃度。為證實是否在適當的條件下進行采血和處理，使用修飾的Fleming方法對血紅蛋白進行分光光度檢測。

隨著動物年齡的增加，血清總蛋白含量也相應地提高。使用自動化的Biuret方法進行總血清蛋白的檢測，以確認動物年齡并驗證符合產品規范。使用色度計在不同波長下檢測樣品和Biuret試劑混合波的吸光度。自動計算結果后，與標準曲線比較，即可得到蛋白值(克/公升)。

穩定性檢測程序：在每一個標記為體外診斷的產品上顯示的效期表明了這個產品具有多長時間的效能。我們的穩定性程序確定和證明了產品效期。我們定期監測批量產品，確定產品在推薦貯存條件下具有可接受效果的時間長度。

微生物學檢測：所有血清使用Barile&Kern的大體積方法檢測支原體。在推薦方法的檢測范圍內檢測結果是準確的。樣品少應該在肉湯中合并培養3個星期，同時要在瓊脂平板上進行不少于4次傳代培養。在有氧和厭氧(95%氮，5%CO2)條件下，平板在36±2℃下孵育。在檢測過程中，每周對瓊脂平板進行一次微生物生長情況檢驗。使用Dienes染色法對懷疑被污染的瓊脂平板進行支原體菌落的檢測。然后，對平板進行再次鏡檢。對孵育肉湯瓶要定期進行濁度和pH值變動的檢測。在推薦方法檢測范圍內，所有血清也要使用Hoechst熒光DNA染色法進行不可在肉湯中培養的支原體(包括M.hyorhinis屬)檢測。

病毒檢測：已知無外來物質的細胞培養基須經過在包含15%測試血清的生長培養基中進行為期21天的三次傳代培養。使用對照培養基和已知對外來物質為陰性的血清平行地維持陰性對照培養。整個期間，檢測所有的培養情況，以便發現是否存在病毒誘發的細胞形態改變或致細胞病變效應。在1421天的培養期間，對含有檢測血清的平行培養瓶按下面標準病毒檢測方法進行評估。

將其中一瓶檢測細胞用胰蛋白酶消化，然后把細胞分別加入到總面積為6cm 2 的六室載玻片上。同時準備陰性對照載玻片。在檢測培養的單室載玻片上加入牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛細小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸病毒的染色劑，作為單個的陽性對照。再經過7天培養(總共21天)，利用熒光抗體技術檢測病毒。

通過對檢測培養進行蘇木精伊紅染色，觀察致細胞突變效應(CPE)或其他病毒誘導效應。檢測細胞是否存在CPE效應、內含物、多核體或其他異常效應。

內毒素檢測：我們用阿米巴變形細胞溶解物(LAL)凝膠法來檢測胎牛血清的內毒素含量。

效能檢測：
對每一批次的胎牛血清，我們都進行下述培養效能檢測。選擇血清重要的標準是其支持特殊細胞的生長能力。因此，除了保證血清通過嚴格的品質控制，我們也同時在實驗室條件下對血清的三個重要的培養效能進行檢測：克隆效率、貼壁效果和二倍體成纖維細胞生長促進。

克隆效率分析：克隆效率實驗分析每一批胎牛血清促進小鼠骨髓瘤細胞及其衍生的雜交瘤細胞的克隆和生長能力。下列產品
經驗證可用于該實驗：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每一批胎牛血清都要分別在復制微量滴定平板上加入兩種血清濃度和兩種細胞接種量(10%血清和1cell/孔，4%血清和5cells/孔)的情況下進行分析。克隆分析結果除以已確定的參照血清值得以歸一化。在許多日常雜交選擇程序中具有代表性的是高濃度的血清，而低濃度血清在設計血清批次細微差異放大檢測中有更為嚴格的測試。嚴格的1cell/孔測試是模擬單一雜交選擇的實驗室條件。為每一批次胎牛血清提供的分析證明報告中的克隆效率值為兩次測試條件下的平均值。

克隆分析法：克隆分析法是在復式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進行的。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。
克隆分析按下述方法進行：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和P3x63-Ag8.653(653)在含有10%的胎牛血清的RPM1640中通常保持對數生長期。在顯微鏡下，利用臺盼藍排除法對活細胞進行計數。

2．用RPM1640培養基將儲備細胞懸浮液進行連續稀釋，使其達到預期的25cells/ml和5cells/ml接種濃度。準備含有參照或測試胎牛血清的RPM1640培養基。將這種密度的細胞分配到各個分析生長培養基體積為0.2毫升的孔中，使其分別平均含有5個和1個細胞。

3．將96孔板放入36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養箱孵育約1015天。

4．在孵育期間，用肉眼觀察平板并對用于克隆的孔進行計數。克隆效率按下列方法計算：克隆效率=(陽性孔平均數/孵育孔總數)×100%

5．每一批次胎牛血清維持指示劑骨髓瘤細胞克隆效率的定量按照以下方法測得的相對克隆效率(RCE)進行歸一化：RCE=檢測血清的克隆效率/對照血清的克隆效率貼壁效率分析：貼壁效率分析是利用已轉型的人類細胞系來檢測每一批血清促使持續貼附細胞系的生長能力。選擇已被驗證可以檢測貼壁效率的細胞系A549(人肺腫瘤細胞，ATCC#CCL,185)，是因為它可以區分一批血清維持細胞貼壁和繁殖能力的細微差異。

每一批次胎牛血清都要在兩種血清濃度和兩種細胞接種濃度下(10%血清和100cells/孔，4%血清和200cells/孔)測試三次。在36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養箱孵育約1014天，對被染色的細胞菌落進行計數即可得到其貼壁效率。將結果除以參考的對照血清得以歸一化。通過兩種血清濃度的測試，可以驗證該批次血清在減量和標準水平下維持生長的能力。為每一批次胎牛血清提供的分析證明報告中的貼壁效率值為兩次測試條件下的平均值。

貼壁分析法：使用貼附分析檢測上述每一批測試血清。這種分析法針對每一個血清樣品使用一個6孔板(每室9.6cm 2 )，并可以對三個孔的數據進行平均處理。每一次化驗中，同時測量前期已驗證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內部參考標準。

貼附分析按下述方法進行：

1．A549細胞系用含有10%胎牛血清的DMEM培養基，在36±2℃，以亞融合密度下進行培養。

2．含10%(v/v)和4%(v/v)血清的DMEM由分別在22.5毫升和24毫升DMEM中加入2.5毫升和1毫升胎牛血清配制而成，終有效體積為25毫升。將5毫升含血清培養基分別加入6孔板的每一個孔中。

3．A549培養細胞先經過胰蛋白酶消化，測定活細胞數，然后稀釋細胞懸浮液2,000cells/ml。

4．將0.1毫升細胞懸浮液加入200cells/孔室中，0.05毫升懸浮液加入100cells/孔室中。平板混合后放入36±2℃，5%CO 2 的潮濕培養箱孵育約1014天。

5．孵育后，取出平板，去除生長培養基，用亞甲基蘭-甲醇溶液對菌落進行染色。

6．計算菌落形成，然后按下述方法計算貼壁效率：%貼壁效率=每孔菌落平均數/每孔孵育活細胞平均數×100

7．為方便比較，將測得的貼壁效率數值除以每批檢測血清的相對貼壁效率(RPE)得以歸一化：RCE=檢測血清的貼壁效率/參照血清的貼壁效率二倍體成纖維細胞生長：促進生長分析用于檢測每一批胎牛血清維持難培養的人二倍體成纖維細胞長期生長的能力。

下列細胞系經認證可用于該實驗：

WI-38(人二倍體肺成纖維細胞，ATCC#CCL 75)

WI-38細胞在含5%胎牛血清的低密度(2X10 5 /瓶)復式25-cm 2瓶中孵育，并進行為期三個連續7天的傳代培養。在每一個培養期，細胞都從初始孵育密度開始傳代培養。壓力分層率、成倍繁殖數量和減量血清濃度是每批次促進難培養二倍體細胞的生長血清的嚴格測試指標。通過連續三代培養以減少前一次生長培養基的殘留影響，從而保證得到檢測批促進生長能力的真實結果。為每一批次胎牛血清提供的分析證明報告為第三次傳代培養每復式培養瓶細胞數的平均值。將檢測值除以參考對照值得以歸一化。

二倍體成纖維細胞生長分析法：培養數代WI-38人類二倍體肺成纖維細胞，計算每一代的細胞總數。此項檢測所挑選出的胎牛血清批號能維持難以生長細胞、貼壁性細胞、正常的細胞株生長及存活。

1．準備含5%檢測血清或已驗證合格的參照血清生長培養基，基礎生長培養基為含L-谷氨酰胺的HBME：EBME(1：1)。按要求，在每一次流量變化和分析過程中進行傳代培養時需配制含5%血清生長的培養基。

2．在低代培養水平時，將2X10 5 WI-38細胞加入各個含9.5毫升生長培養基的復式25-cm 2 培養基中。在不擰緊瓶蓋的情況下，將培養瓶放入4-6%CO 2， 36℃±2℃環境中，保持24小時。然后擰緊瓶蓋，將培養瓶放在36℃±2℃下孵育7天，在第2天或第3天全部更換培養基。

3．在第7天，用胰蛋白酶對每一個含參照或檢測血清的復式瓶中的細胞進行消化得到一定數量細胞，然后合并并計數。將2x10 5 WI-38細胞加入含有新鮮生長培養基(已加入了與上一代同一批次的參照或檢測胎牛血清)的新的復式25-cm 2 瓶中，進行細胞傳代培養。按第2步所述，將培養瓶進行平衡并孵育。

4．如上所述經過三代連續分析，在每一代結束時計算每一批參照或檢測血清的每瓶細胞平均數。后一代培養的各批檢測血清實驗中的相對生長率(RGR)作為參照血清實驗中獲得的細胞生長率分子：

%RGR=檢測血清實驗中每瓶平均細胞數/參照血清實驗中每瓶平均細胞數X100S f9細胞生長促進分析。通過昆蟲分析可以保證您購買的胎牛血清批次可以維持S f9細胞的生長。收到產品后，您需要做的就是混勻血清，在56℃下熱滅活30分鐘。這種分析法也可以用于乳白蛋白水解產品、酵母和其它生長輔料作為原料的生物效能分析。該分析法的準確性取決于是否用常規的細胞培養方案進行培養。用臺盼藍染色排除法測得的細胞活性少不低于80%。

細胞生長分析法。

1．使用含10%檢測或參照熱滅活胎牛血清的已驗證的Grace昆明培養基配制*檢測培養基。

2．將儲備Sf9細胞加入50毫升離心管中，在50Xg下離心5分鐘。然后將每支試管的沉淀物重新用含10%的檢測或參照熱滅活胎牛血清*培養基配制成懸浮液。

3．反試管顛倒幾次，然后每支試管倒出1毫升樣品。用臺盼藍染色排除進行活細胞計數。

4．如果活性≥80%，把試管再顛倒幾次并取出0.25毫升樣品。然后用Coulter計數器進行細胞計數。

5．將細胞加入Erlenmeyer瓶中，使其終細胞濃度為2.75X10 5 cells/ml。孵育后，再一次進行細胞計數，以保證細胞密度為2.5X10 5 3.0X10 5 cells/ml。

6．將培養瓶放到搖床上，在27℃±1℃、80-90rpm條件下孵育96小時。

7．從每一培養瓶中分別取出0.25毫升樣品，用Coulter計數器進行計數。同時取出一定量的樣品進行細胞活性檢測。

8．將檢測細胞密度與參照細胞密度相比即可得到相對細胞密度(RCN)。

噬菌體檢測:我們利用溶菌斑分析法來檢測是否存在噬菌體。從每一批血清中取具代表性的樣品加入胰蛋白酶磷酸瓊脂中，并在其加入含有噬菌體敏感的大腸桿菌懸浮液(C-3000或K-12)。然后，混合物會在胰蛋白酶磷酸瓊脂平板上分層，在36±2℃環境下孵育約24小時后，觀察平板上溶菌斑的形態。

生化特征檢測。

血紅蛋白檢測：所有批次的胎牛血清我們都進行了血紅蛋白的檢測，血紅蛋白含量低于《中國生物制品主要原輔材料指控指標》(2000年版)公布的指標。

效能檢測：其它血清

新生牛血清。檢測新生牛血清維持超過三代VERO細胞生長的能力。在每一個培養期，細胞都從初始孵育密度開始傳代培養。可將所得結果與使用含有已知特征的參照血清對照生長培養基獲得的平行結果進行比較。

馬血清。每一批馬血清被檢測維持在含有檢測批血清的對照培養基上Sp2/0-Ag14(小鼠骨髓瘤)細胞生長的能力。可將所得結果與使用含有已知特征的參照血清對照生長培養基獲得的平行結果進行比較。

血清的使用與儲存：正確的使用及保存血清，才能使血清發揮應有的作用。

1. 儲存條件：血清一般儲存于－20℃，同時應避免反復凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前融化。融化時好先置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應盡快使用。

2. 使用濃度：自從有了合成培養基，血清就是作為一種添加成分與合成培養基混合使用，使用濃度一般為5－20％，常用是10％。過多血清容易使培養中的細胞發生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發生惡性轉化。

關于使用中的常見問題

1.保存血清好的辦法？
我們建議血清應保存在-5℃-20℃。若你一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。

2.如何解凍血清才不會使產品質量受損？
我們建議您將血清從冷凍箱中取出后，先置于2-8℃冰箱中使之溶解，然后在室溫下使之全溶。但必須注意的是，溶解過程中必須規則地搖晃均勻。

3.血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理？
血清中沉淀物的出現有許多原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性造成的；而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。

若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝無菌離心管中，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養基內一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。

4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？
一般以56℃，30分鐘水浴來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活性，而補體所參與的反應有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經過處理的血清對細胞生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。

而經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點"，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者認為是微生物的分裂擴增。因此我們建議您，若非必須，您可以不需要做熱滅活這一步。如此以來，不但節省您寶貴的時間，更確保您血清的質量！

5.如何避免沉淀物的出現？
我們建議您在使用血清的時候，注意正確的血清解凍步驟，并盡量避免滅活血清及長時間的將血清置于高溫環境中。

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